抑郁症是一种病理机制尚不明确的精神障碍性疾病，已成为当代社会威胁人们健康的重要疾病。目前临床上使用的抗抑郁药主要是基于“单胺神经递质假说”而研发的单靶点药物，包括选择性5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂、选择性去甲肾上腺素（NA）再摄取抑制剂、选择性NA/5-HT再摄取抑制剂、单胺氧化酶抑制剂（MAOI）及5-HT受体激动剂等[1]。但这些药物有效率较低、不良反应多，停药后易复发，从而限制了其在临床上的广泛应用[1]。随着中医药的发展，中药或中药单体为治疗抑郁症带来了新的方向。
石菖蒲为天南星科多年生草本植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott的干燥根茎，具有开窍豁痰、醒神益智功效，临床上主要用于神经系统疾病的治疗[2]。石菖蒲是抗抑郁中药复方使用频次较多的药物之一，石菖蒲单味药的不同提取部位均能抗小鼠抑郁和焦虑行为[3]，但石菖蒲抗抑郁作用的物质基础和作用机制尚不明确。本研究采用分子对接技术，以单胺氧化酶A（MAO-A）、多巴胺转运体（DAT）、5-羟色胺转运体（SERT）和组胺H1受体（H1R）为作用靶点，研究石菖蒲抗抑郁的物质基础和作用机制，为其进一步开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 配体库的建立
采用传统中药药理数据库（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php?）建立石菖蒲口服易吸收化合物库[4]。以石菖蒲为关键词检索到105个化合物，利用口服生物利用度（OB）≥30%进行二次筛选[5]，得到65个化合物（包括 Beta-细辛醚、Alpha-细辛醚），占到总化合物的61.90%。用ChemBio 3D绘制候选化合物（配体）的三维结构，并使用MM2力场进行构象优化，将处理完毕的小分子保存为Mol2的格式，最后使用AutoDock tools（ADT）保存为PDBQT的格式备用。
1.2 受体蛋白的准备
抑郁症相关药物靶点参考治疗靶蛋白数据库（therapeutic target database TTD，http://bidd.nus. edu.sg/group/cjttd/），结合文献报道[6-8]，选取与抑郁症相关的4个靶点蛋白作为受体蛋白，分别为代谢多巴胺（DA）、5-HT和NA的MAO-A；与DA摄取、转运有关的DAT；与5-HT摄取、转运相关的SERT；以及与镇静、抗焦虑有关的H1R。靶点蛋白结构全部来自于RCSB蛋白数据库（http://www.rcsb.org/），靶点代号（PDB ID）以及其蛋白结合的原配体见表1，用ADT对原PDB文件进行下列处理：（1）去除溶剂分子（即水分子）；（2）去除配体分子；（3）蛋白分子加极性氢。
1.3 对接参数的设置以及验证
采用的分子对接软件为斯克利普斯研究所Olson课题组开发的AutoDockVina，进行半柔性分子对接计算。AutoDockVina采用复杂的梯度优化算法来加快局域极小化的过程，并采用了多线程技，相比AutoDock 4在速度上提升了约2个数量级且精度更好[9]。半柔性对接指的是对接中小分子配体的构象是柔性，可以发生改变，而受体蛋白则是刚性，不发生变化。以靶点蛋白原配体作为中心设置格点，设置的中心坐标以及盒子大小见表2。
使用Chimera[10]软件将靶点蛋白的原配体的构象抽取出来，保存为PDB的格式，并用ADT处理为 PDBQT的格式备用。然后利用Autodock Vina将原配体对接回去，选取能量最低的构象与原配体计算均方根偏差（RMSD）、亲和力（Ki）以衡量参数设置的合理性。利用软件VMD计算RMSD，Ki根据以下公式计算，Ki＝exp[(ΔG×1 000)/(Rcal×T)]，其中ΔG单位为kcal/mol，T＝298 K，Rcal＝1.987 19 cal/(mol∙K)。根据最低对接能、RMSD、Ki衡量参数设置是否合理。对接参数以及结果见表2。
以上靶点蛋白的原配体均能成功对接到靶点蛋白的活性中心上，RMSD均小于0.20 nm，并且其Ki分别为416.49、54.90、16.83、65.00 nmol/L，与文献报道[11-14]的生物活性处于同一数量级，表明对接参数设置合理。
1.4 石菖蒲的化学成分与靶点蛋白的分子对接及其筛选标准
分别用处理好的候选化合物与上述4个靶点使用AutoDockVina进行对接，并计算Ki。根据候选化合物和阳性药的整体对接结果，避免高得分（亲和力）化合物的屏蔽作用，减少假阴性化合物的产生，将每个靶点的亲和力排名前10%（前7位）的化合物（如有亲和力相同的化合物则并列）认定为阳性结果[15]。利用Pymol与Ligplot分析和观察化合物与蛋白的对接结果[16-17]。
2 结果
2.1 石菖蒲中化学成分与4个靶点蛋白的作用情况
通过使用AutoDockVina对石菖蒲中OB≥30%的65种化合物和4个靶点蛋白进行对接，发现了18种潜在活性化合物，结果见表3。能够同时作用4个靶点的为异紫花前胡内酯、山柰酚、2″-O-甲基异甘草苷元、8-异戊烯基山柰酚。能同时作用2个靶点的有佛手柑内酯、橙花叔醇、环阿屯醇。其余11种化合物能与1个靶点发生相互作用。因此石菖蒲中多成分可能通过抑制DA等神经递质的代谢、减少DA、5-HT的摄取和抑制H1R的活性等发挥抗抑郁作用。
2.2 潜在活性化合物与各靶点的亲和力、氢键作用以及疏水作用
18种候选化合物与4个靶点的对接结果见表4～7。与MAO-A有较强亲和力化合物有7种，而且9-氨基吖啶、异紫花前胡内酯、山柰酚、2″-O-甲基异甘草苷元4种化合物的作用强于原配体肉叶芸香碱（去氢骆驼蓬碱，harmine）；与DAT有较强亲和力的化合物有10种，环阿屯醇、8-异戊烯基山柰酚的亲和力作用超过原配体去甲替林；与H1R有较强亲和力的化合物有9种；与SERT有较强亲和力的化合物有7种，其中环阿屯醇、8-异戊烯基山柰酚、山柰酚与靶点蛋白的亲和力大于或等于阳性药S-西酞普兰。
9-氨基吖啶是一种含氮原子的杂环化合物，经过TCMSP数据库查阅是石菖蒲中独特含有的一种化合物，它与MAO-A的亲和力很强，其可能是石菖蒲抗抑郁的主要物质基础。环阿屯醇是植物甾醇类化合物，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗阿尔茨海默病等多种活性[18]。本研究中，首次发现环阿屯醇与DAT、SERT具有很强的亲和力，因此环阿屯醇有可能开发成具有抗抑郁活性的中药单体或先导化合物，或推进含环阿屯醇的中药应用于抗抑郁。
选取与每个靶点蛋白亲和力最高的化合物，做出化合物与蛋白结合图，可直观观察活性化合物与靶点的结合模式以及与周围氨基酸残基的相互作用，结果见图1。
9-氨基吖啶占据了由残基Ile180、Asn181、Gln215、Ile335、Leu337、Met350、Tyr407、Tyr444和Fad600形成的活性空腔，其氨基与Asn181形成一个氢键，其环状结构与Tyr407形成π-π堆积作用。Upadhyay等[19]研究结果表明，能否与Phe208、Asn181、Tyr407相互作用，是决定化合物能否与MAO-A活性中心结合的关键，这与本研究对接结果相符。另外，原配体肉叶芸香碱与Tyr407也存在一个π-π堆积作用，这表明Tyr407是化合物能否与MAO-A结合的一个关键残基。
DAT的活性空腔组成除Ser421和Ser422外均为疏水残基，而环阿屯醇为仅具有1个羟基的三萜类结构，即疏水作用是环阿屯醇与DAT结合的主要推动作用。Penmatsa等[20]研究表明，与氨基酸残基Phe43、Val120相互作用是抗抑郁活性的关键，这进一步验证了本研究结果的的可靠性。
山柰酚的3、7、1号的氧原子与Ser111、Thr194、Tyr431形成氢键，其环状结构与Tyr108、Trp428、Phe432、Phe435、Ile454存在疏水作用，且与Tyr431、Phe432存在T型的π-π堆积作用。Heifetz等[21]研究结果也表明，化合物与氨基酸残基Asp107、Tyr108、Ser111、Thr112、Asn198、Phe199、Trp428、Tyr431、Phe432、Tyr458是H1R与化合物作用的关键残基。
SERT的活性空腔主要由Tyr95、Ile172、Ala173、Tyr176、Phe335、Gly338、Phe341、Val343、Gly338、Ser439、Glu493组成，环阿屯醇很好地占据了SERT的活性空腔，且与Tyr95、Ile172、Tyr176、Phe335和Phe341存在较好的疏水作用，这可能是其较好得分的原因。Henry等[22]的定点突变实验表明，Tyr95和Ile172是SERT的关键残基，与本研究结果相一致。
3 讨论
本研究共筛选出石菖蒲的18种化合物与抗抑郁作用的靶点蛋白有相互作用，其中黄酮类3种、香豆素类2种、甾醇类1种、挥发油类9种、木脂素类1种、其他类2种，挥发油类占多数，这与石菖蒲的药理作用的主要物质基础是挥发油相一致[23-24]。但将石菖蒲主要挥发油成分β-细辛醚进行分子对接，发现其抑制单胺氧化酶和单胺类转运体的作用较差，表明β-细辛醚可能通过其他机制发挥抗抑郁作用，如显著抑制大鼠脑皮质神经细胞和海马神经细胞凋亡[25]。
本研究中有4种化合物能同时作用于上述4个靶点，分别为异紫花前胡内酯、山柰酚、2″-O-甲基异甘草苷元和8-异戊烯基山柰酚，后3种为黄酮类化合物。已有文献报道黄酮类化合物具有抗抑郁的活性[26]，王佳等[27]通过实验验证了山柰酚具有抗大鼠抑郁的作用，能提高抑郁症大鼠脑内NA、DA、5-HT的水平，与本研究虚拟筛选结果一致。8-异戊烯基山柰酚的脂溶性比山柰酚大，更有利于透过血脑屏障，有利于其发挥抗抑郁的效果，有待后续的药理实验验证。异紫花前胡内酯为香豆素类化合物，本研究发现其具备较强抗抑郁的潜在活性。香豆素类化合物是一类广泛存在于药用植物的活性物质，其具有广泛的药理活性，如抗病毒、抗炎、抗肿瘤等[28]；但香豆素抗抑郁作用鲜见文献报道，本研究为香豆素类化合物开发为抗抑郁药物提供了理论导向。
已有一些石菖蒲抗抑郁作用及作用机制的实验报道。吴全娥等[29]研究表明尖叶假龙胆配伍石菖蒲能显著提高大鼠脑内5-HT的水平；周天等[30]研究结果表明，石菖蒲提取物及其低极性部位能显著改善抑郁模型小鼠的抑郁症状，并且能显著升高小鼠脑内5-HT和ACTH；刘梅等[31]研究结果表明，含有石菖蒲的藜欢解郁胶囊，能显著增加抑郁小鼠血清NA、DA、5-HT的含量发挥抗抑郁的作用；以上实验结果可以佐证本研究虚拟筛选的作用靶点选择合理。
本研究中石菖蒲的18种活性化合物中有9种与H1R有较好的亲和力，抗焦虑抑郁药多虑平与H1R的亲和力高于一般抗组胺药，但石菖蒲抗抑郁的作用是否与其抗组胺作用有关还需要进一步研究。
本研究通过分子对接技术筛选出18种石菖蒲中的抗抑郁的活性成分，其中与靶点蛋白作用活性较强的化合物有3种，分别为9-氨基吖啶、山柰酚和环阿屯醇。这些化合物的抗抑郁活性有待于进一步生物实验验证。
参考文献（略）
来 源：刘永杰，向慧龙，陈 浩，徐凌云. 基于分子对接技术石菖蒲中抗抑郁活性成分的筛选 [J]. 中草药, 2019, 50(11):2612-2619.
