摘 要：紫草素是从传统中药紫草中提取的萘醌类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、促进伤口愈合等作用。近年来，紫草素及其衍生物的抗肿瘤作用得到广泛研究。多项体外和体内研究表明紫草素及其衍生物可有效抑制乳腺癌、宫颈癌等妇科恶性肿瘤的发生与发展。从阻滞细胞周期、促进肿瘤细胞凋亡、抑制癌细胞转移和侵袭、诱导自噬和坏死等方面综述近几年紫草素及衍生物在抗妇科肿瘤领域的研究进展，为紫草素类化合物在妇科肿瘤中的临床研究提供参考。
紫草为临床常用中药，最初记载于《神农本草经》，味苦、性寒，有凉血、活血、解毒等功能，可用于体表清热、内服解毒、局部伤口活血化瘀[1]。多项研究发现紫草还有显著的抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤的药理作用[2]。紫草的活性成分主要是提取于其干燥根部的萘醌类（naphthoquinone）色素，较为常见及研究较多的包括硬紫草Lithospermum erythrorhizon Sieb. etZucc. 的主要成分紫草素（右旋紫草素，shikonin，1，图1）；新疆软紫草Arnebia euchroma Johnst的主要成分阿卡宁（左旋紫草素，alkannin，2，图1），为紫草素的对映异构体[3]；还有从内蒙紫草Arebia guttata Bunge中提取的异戊酰紫草素（isovaleryl shikonin）[4]，其他紫草素天然衍生物如乙酰紫草素、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰紫草素和Beta,beta-二甲基丙烯酰紫草素等[5]。
近年来，紫草素的药理活性尤其是抗肿瘤作用得到广泛研究[6-7]。为降低其对正常细胞的毒性和提高抑癌效率，研究者对紫草素的结构进行了改造，其分子结构中可供修饰的位点主要包括母核萘茜环、含有6个碳原子的侧链及侧链上羟基，从而得到了多种不同的合成衍生物[8-9]，如2-二硫代氨基甲酸酯- 3-甲基取代类萘醌化合物、侧链羟基经改造产生的香豆素-羧基紫草酸酯衍生物PMMB229-240、1,4-二肟-5,8-二甲氧基萘、芳基二氢噻唑酰基紫草素酯衍生物等，且研究了它们对癌细胞和正常细胞的毒性，结果显示紫草素合成衍生物具有更良好的应用前景。现就紫草素及其衍生物对4种常见的妇科恶性肿瘤乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌及子宫内膜癌的抗肿瘤效应和作用机制进行综述。
1 紫草素抗妇科肿瘤作用研究
1.1 抗乳腺癌
Chen等[10]研究紫草素、乙酰紫草素和β,β-二甲基丙烯酰紫草素对人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞和小鼠乳腺癌4T1细胞的毒性作用发现，紫草素对4T1细胞生长有明显抑制作用。紫草素处理72 h对4T1细胞半数抑制浓度（IC50）为（0.83±0.03）μmol/L，对MDA-MB-231细胞的IC50为（1.13±0.06）μmol/L，而对正常乳腺上皮细胞毒性较弱，IC50为（3.76±0.09）μmol/L。乳腺癌肺转移模型小鼠连续给予紫草素（10 mg/kg）14 d后，治疗组小鼠肺转移结节总数明显少于对照组，结节体积较小，肺转移灶面积也明显减小。结果表明紫草素可抑制乳腺癌细胞肺转移。
Yang等[11]发现人乳腺癌SK-BR-3细胞经不同浓度的紫草素处理48 h后增殖速率降低，凋亡率升高，且具有浓度依赖性，其中紫草素1 μmol/L处理组细胞增殖率为（24±4）%，凋亡率为11.6%，与对照组比较差异显著。此外，紫草素0.1、1、10 μmol/L处理人乳腺癌MCF-7细胞24 h后[12]，随紫草素浓度升高，细胞增殖抑制率和凋亡率显著升高。以上结果表明紫草素能剂量依赖性地抑制乳腺癌细胞的生长。
1.2 抗宫颈癌
用紫草素衍生物β-羟基异戊酰紫草素（β-hydroxyisovalerylshikonin，β-HIVS）1、5、10 μmol/L处理人宫颈癌HeLa细胞不同时间后[13]，结果表明，β-HIVS呈时间和剂量依赖性地抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，同时细胞周期分布也发生明显改变，G0/G1期细胞数减少，S期细胞数增加，而G2/M期细胞数无明显变化，证明β-HIVS能将宫颈癌细胞的细胞周期阻滞在S期。Lin等[14]将丙酮酸脱氢酶（PDH）的辅助因子α-硫辛酸引入紫草素中，合成具抗有丝分裂和糖酵解的双效化合物，得到18种α-硫辛酸紫草素酯衍生物，其中化合物1C（图2）对HeLa细胞具有最强的细胞毒性，IC50值为（3.14±0.58）μmol/L。一方面其作为微管蛋白抑制剂在G2/M期引起HeLa细胞周期阻滞。HeLa细胞移植瘤小鼠经不同剂量（0.5～2.0 mg/kg）1C处理后，肿瘤体积均小于对照组，其中2 mg/kg处理组小鼠平均肿瘤体积比对照组小5倍，表明1C以剂量依赖方式抑制异种移植肿瘤生长，但不影响小鼠体质量。另一方面其通过磷酸肌醇依赖性蛋白激酶（PDK）活性的抑制促进了PDH活性，迫使HeLa细胞更多地进行好氧代谢，诱发其凋亡。
紫草素作用于体外培养的人宫颈癌SiHa细胞后[15]，细胞增殖指数下降，G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，且呈浓度依赖性，证明紫草素能够阻滞SiHa细胞的G0/G1期进程而抑制细胞增殖。紫草素处理人宫颈癌Caski细胞12、24、36 h后[16]发现细胞增殖抑制率逐渐升高，侵袭数量降低，磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）表达量升高，并呈时间和剂量依赖性。说明紫草素可抑制宫颈癌细胞增殖和侵袭过程。
1.3 抗卵巢癌
人卵巢癌细胞SKOV3和A2780经紫草素（5、10 μmol/L）处理后[17]，与对照组比较，凋亡率无明显变化，但细胞中坏死性凋亡相关蛋白水平均明显上调，坏死细胞比例明显增加。说明紫草素以剂量和时间依赖性地抑制卵巢癌细胞增殖并诱导其发生坏死性凋亡，而对人正常卵巢上皮IOSE-80细胞的影响很小。
紫草素可明显逆转人卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV3/DDP的耐药性，且在顺铂浓度为12.5 μmol/L时效果较为显著，化疗联合使用紫草素可显著抑制癌细胞周期G1/S转化，对比单用顺铂组，紫草素和顺铂联用组的细胞早期凋亡率上升[18]。P-糖蛋白（P-gp）是一种能量依赖性跨膜转运蛋白，常作为肿瘤多药耐药性（MDR）的标志物。紫草素1 μmol/L、紫杉醇1 μmol/L单独使用或联合使用处理人卵巢癌耐药细胞A2780/PTX 24 h可明显诱导癌细胞凋亡，凋亡率分别为6.3%、10.6%和30.9%，进一步研究发现紫草素以不依赖P-gp蛋白的方式逆转A2780/PTX细胞对紫杉醇的耐药性[19]。这暗示紫草素与其他抗癌药物联合使用可能为治疗卵巢癌及其他癌症提供新的治疗策略。
1.4 抗子宫内膜癌
子宫内膜癌中有70%～80%为雌激素依赖型，孕激素治疗是主要的内分泌治疗措施，但超过30%的早期患者对孕激素不敏感[20-21]。雌激素对雌激素受体阳性的人子宫内膜癌Ishikawa细胞有促进增殖作用，但在含有10 nmol/L雌激素的培养液中逐渐增加紫草素浓度，细胞增殖抑制率显著升高，且具有浓度和时间依赖性[22]。另外用不同浓度的紫草素分别处理4种人子宫内膜癌细胞Ishikawa、HEC-1A、KLE和RL95-2 24 h，发现紫草素以剂量依赖的方式降低癌细胞活力，对4种细胞的IC50分别为3.63、4.81、8.22、8.96 μmol/L。Ishikawa和HEC-1A细胞对紫草素更为敏感，经紫草素5 μmol/L处理24 h后，细胞凋亡率均明显增加[23]。紫草素可抑制人子宫内膜癌RL95-2细胞的增殖并促进其凋亡[24]，具有剂量和时间依赖性，其中1.2 μg/mL促凋亡效果最佳，细胞凋亡率为（29.57±3.24）%。以上结果提示紫草素对不同子宫内膜癌细胞具有不同程度的促凋亡作用，且具有浓度和时间依赖性，其中对Ishikawa细胞的抑制生长和促凋亡活性更强。
2 紫草素抗妇科肿瘤的作用机制
2.1 抑制肿瘤细胞增殖
恶性增殖是癌细胞最显著的特征，大量实验表明紫草素可通过多个靶标分子和信号通路抑制肿瘤细胞增殖。有研究发现[25]紫草素能够在mRNA和蛋白水平诱导双特异性磷酸酶（DUSP1）和DUSP2的表达，降低其下游信号分子c-jun N端激酶（JNK）和p38的活性，阻滞细胞周期中的G1期，进而抑制MCF-7、MDA-MB-231和SK-BR-3细胞增殖。多项研究[15,18,20]发现不同浓度紫草素作用于SiHa、SKOV3/DDP、Ishikawa细胞后，G0/G1期细胞比例显著增高，G2/M期细胞比例显著降低，S期细胞比例降低，其作用机制与G蛋白偶联雌激素受体（GPER）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、细胞周期依赖性蛋白激酶2（CDK2）等蛋白表达水平下调有关。
细胞分裂周期蛋白25（Cdc25）通过调节其底物CDK的磷酸化状态，在细胞周期进程中起着至关重要的作用。紫草素能够抑制Cdc25磷酸酶活性，浓度依赖性地抑制CDK1去磷酸化，从而抑制MCF-7和HeLa细胞增殖，体内实验证明紫草素1、5、10 mg/kg对异种移植肿瘤模型小鼠有良好的抗癌细胞增殖作用，阻滞细胞于G2/M期[26]。
来源于MCF-7细胞的外泌小体可以被肿瘤细胞本身吸收，从微环境中快速获得的miR-128外泌体能下调促凋亡基因Bax，保护癌细胞免受程序性死亡，并通过miR-128的传递促进MCF-7细胞增殖。qRT-PCR法检测发现经紫草素1 μmol/L处理的MCF-7细胞miR-128外泌体释放减少，提示紫草素可以通过改变肿瘤微环境来抑制肿瘤增殖[27]。
2.2 诱导肿瘤细胞凋亡
细胞凋亡是从体内去除衰老细胞的自然途径，然而癌细胞中凋亡信号失调和抗凋亡系统的激活允许癌细胞逃避凋亡程序，不受控制地增殖从而导致肿瘤存活。许多抗癌疗法通过诱导细胞凋亡及其相关的细胞死亡网络而起作用，紫草素也不例外。
紫草素对4T1和MDA-MB-231细胞的凋亡均有诱导作用。经2 μmol/L紫草素处理后，4T1细胞中p38、JNK及磷酸化JNK蛋白水平与对照组差异不明显，而磷酸化p38蛋白表达水平升高，提示紫草素是通过激活p38信号通路而非JNK信号通路，提高Caspase-3/7蛋白表达水平，诱导4T1细胞凋亡[28]。紫草素9 μmol/L可使人卵巢癌耐顺铂细胞A2780-CR的存活率降低50%，呈时间依赖性地升高JNK、促分裂原激活蛋白激酶（MAPK）和胞外信号调节激酶（ERK）的磷酸化水平，表明紫草素可通过激活MAPK信号通路诱导A2780-CR细胞凋亡。同时发现紫草素能降低卵巢癌细胞内Bcl-2水平，提高Bax、Caspase-9和Caspase-3的水平，降低线粒体膜电位（Δψm），升高从线粒体释放到胞浆的细胞色素C水平，提示紫草素通过线粒体依赖途径诱导癌细胞凋亡[29]。
实体肿瘤具有非常独特的生理特征，如血管异常和瘤内缺氧。为了防止氧耗竭导致的细胞死亡，癌细胞往往高表达低氧诱导因子（HIF-1α）。人工合成的香豆素-羧基紫草酸酯衍生物PMMB232能够剂量依赖性地促进HeLa细胞凋亡，凋亡细胞比例为38.0%，明显高于紫草素处理组的凋亡细胞比例（20.8%）。PMMB2328 μmol/L处理HeLa细胞后HIF-1α表达显著降低，与相同浓度的紫草素处理组结果相似，分子对接计算发现PMMB232能与HIF-1α稳定结合，促进HIF-1α的降解而诱导肿瘤细胞凋亡[30]。
磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素蛋白（mTOR）/PTEN通路在多种癌症中被激活，在抑制细胞凋亡和促进增殖方面起着关键作用，是一条相对独立且复杂的途径，与HIF-1α等多种途径也密切相关。紫草素通过抑制原癌基因miR-106b在子宫内膜癌细胞HEC-1A、KLE和RL95-2中的表达来上调抑癌基因PTEN，上调的PTEN可拮抗PI3K信号转导，抑制Akt/mTOR通路从而促进细胞凋亡，而miR-106的过表达则显著减弱紫草素诱导的细胞凋亡[23]。
2.3 抑制癌细胞侵袭和转移
控制癌细胞侵袭和肿瘤转移对于改善癌症患者的预后具有重要意义。紫草素可通过上调糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）水平而增强β-连环蛋白（β-catenin）的磷酸化，减少β-catenin的表达与核积累，抑制其与T细胞因子（TCF）的结合，从而抑制上皮间质转换（EMT）相关基因的转录，下调间质标记物N-钙粘蛋白表达，降低波形蛋白和Snail蛋白水平，升高上皮标记物E-钙粘蛋白水平，表明紫草素通过抑制Wnt/β-catenin信号通路逆转MDA-MB-231和4T1细胞的EMT，从而抑制乳腺癌细胞转移和侵袭[10]。紫草素9 μmol/L处理A2780-CR细胞48 h后[29]检测发现E-钙粘素水平升高，N-钙粘素水平降低，表明紫草素也能逆转卵巢癌细胞EMT从而减弱其迁移能力。
紫草素衍生物PMMB232处理的HeLa细胞[30]中HIF-1α的表达量比对照组下降了3倍，同时E-钙粘蛋白表达显著上调，细胞间黏附力加强，肿瘤细胞迁移和转移减慢，表明紫草素通过下调HIF-1α表达而抑制癌细胞侵袭和转移。
另有研究发现紫草素以剂量依赖性的方式有效地抑制信号传导及转录激活蛋白3（STAT3）的激活和表达，并抑制局部黏着斑激酶（FAK）的活性和Src的表达来阻碍MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7和4T1细胞的侵袭性生长和转移[31]。
2.4 诱导坏死、自噬和细胞免疫
与凋亡不同的是，坏死是一种不依赖Caspase的非程序性细胞死亡，主要受受体相互作用丝氨酸蛋白激酶1（RIP1）和RIP3的调控，也与细胞内活性氧（ROS）含量相关，ROS升高引起严重的DNA损伤和基因突变及肿瘤细胞的活性炎症，对于肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移和血管生成具有促进作用[32]。
紫草素能够促进MDA-MB-468细胞内肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与肿瘤坏死因子α受体1（TNFR1）结合，刺激细胞质膜上形成死亡复合物I（包括TRADD、TRAF2、RIP1K和CIAP1）。被Necrostatin-1阻断的坏死复合物IIb的形成需要RIP1K的激酶活性，紫草素使细胞质内ROS含量上升，提高RIP1K、RIP3K和混合系列蛋白激酶样结构域（mixed lineage kinase domain-like，MLKL）的磷酸化水平，导致这3种蛋白相互作用介导的坏死复合物IIb形成，进而增加线粒体ROS的产生，降低Δψm，导致肿瘤细胞坏死[33]。使用DCFH-DA荧光探针检测发现紫草素处理后的SKOV3和A2780细胞内ROS水平显著升高，说明紫草素通过促进卵巢癌细胞中ROS过量积累而激活坏死性凋亡进程[17]。
免疫原细胞死亡（ICD）一般通过释放损伤相关分子模式（DAMPs）介导，宏观自噬活性增强通常伴随着坏死的发生[34]。用紫草素处理小鼠乳腺癌4T1-luc2细胞，引发RIPK1和RIPK3依赖性坏死[35-36]，伴随着细胞自噬增强引起膜表面DAMP（ectoDAMP）上调，从而激活共培养树突状细胞（DCs），以抑制原发性癌细胞转移，用紫草素和氯喹联合处理4T1-luc2细胞比单用紫草素更能增强免疫原活性和基于DCs的癌症疫苗效应。
2.5 抑制糖酵解
肿瘤通常利用糖酵解为自身代谢和生长提供能量，即Warburg效应，丙酮酸激酶M2（PKM2）不仅是控制糖酵解最后一步的限速酶[37]，也是癌细胞调节基因表达的蛋白激酶[38]。被表皮生长因子受体（EGFR）激活后的PKM2从细胞质转移到细胞核，激活β-catenin，诱导编码周期蛋白D1的基因（CCND1）和癌基因c-Myc表达，上调葡萄糖转运体1（GLUT1）和乳酸脱氢酶A（LDHA）水平，增加了葡萄糖的消耗和乳酸的产生，进而促进了肿瘤的发生[39]。
紫草素可以抑制MCF-7细胞中的丙酮酸激酶、己糖激酶、磷酸果糖激酶-1、双磷酸果糖醛缩酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶的活性，从而降低癌细胞的糖酵解率[40]。1 μmol/L紫草素处理24 h后MCF-7和MDA-MB-231细胞中PKM2活性下降，HIF-1α和血管内皮生长因子（VEGF）表达量减少，细胞迁移能力降低，提示紫草素可以通过靶向PKM2/ HIF-1α轴来抑制乳腺癌细胞的迁移[41]。此外紫草素也能剂量依赖性地抑制SKOV3和CP70细胞内PKM2的活性[42]，显著减少癌细胞对葡萄糖消耗，降低胞外酸化率，从而引起卵巢癌细胞代谢紊乱和抑制其恶性表型。研究者设计出一系列新型萘醌衍生物[43]，其中哌啶基替代化合物3K具有比紫草素更强的抑制PKM2活性的能力，其IC50为（2.95±0.53）μmol/L，而紫草素对PKM2的IC50为（8.82±2.62）μmol/L；3K也具有更强的抑制HeLa细胞增殖的能力，IC50为（0.29±0.11）μmol/L，紫草素对HeLa细胞的IC50为（2.45±0.81）μmol/L。
3 结语
国内外大量研究发现紫草素可通过多条信号通路和多个分子靶点（如Wnt/β-catenin、PI3K/Akt/ mTOR/PTEN、p38-MAPK、Bcl-2/Bax、ROS/HIF-1α、STAT3、RIPK1/RIPK3和PKM2等）抑制妇科肿瘤的多种细胞增殖、侵袭和转移，诱导癌细胞凋亡、坏死和自噬，从而发挥抗肿瘤效应。
尽管多项体外实验和体内动物实验已经证实了紫草素的抗肿瘤作用和机制，但还没有紫草素或其衍生物作为抗肿瘤药物独立应用于临床，通常都是伴随化疗药物，相互作用以增强抗癌效果[18-19]。限制因素主要有紫草素有效浓度相对较高，且可能存在一些副作用，缺乏抗肿瘤作用的特异选择性。研究者近几年致力于改变其结构以获得效力更强、副作用更小的紫草素及萘醌衍生物，并取得一定的进展，如1C、3K、PMMB232等合成衍生物对HeLa细胞有更强的抑制效应[14,30,43]。此外，紫草素不溶于水，溶于乙醇、有机溶剂和植物油，给药方式差异也会影响其效力，近年药物化学和纳米技术领域迅速发展，创造了基于紫草素的新型衍生物和纳米制剂，使其药理功能得到了改进。研究者用经典的成乳工艺制备紫草素微乳（SKN-MEs），再通过EDC/NHS缩合技术制备成CD133抗体修饰的紫草素微乳[44]，能显著抑制MDA-MB-231干细胞的成球性，异种移植实验显示其体内抑瘤率为78.5%，显著高于紫草素组（31.3%）。
目前，对紫草素抗肿瘤的研究多停留在分子水平，随着全基因组测序、基因组编辑和定量蛋白质组学分析等新技术的出现，可以对紫草素抗癌功能的分子靶点和信号途径有更彻底和更准确的认识，这些信息有助于开发紫草素或其衍生物作为有效的抗癌药物，也需要更多的动物模型和临床试验以验证紫草素用于临床治疗的有效性和安全性。
参考文献（略）
来 源： 陈 静，侯 尧，伍春莲．紫草素及其衍生物抗妇科肿瘤作用研究进展 [J]. 中草药, 2020, 51(14):3814-3820.
