摘 要：目的 基于网络药理学方法探讨黄芪抗疲劳可能的作用机制。
方法 根据课题组前期研究并结合中医药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）指认黄芪中的活性成分，采用PharmMapper网络服务器预测其作用靶点；在GeneCards、OMIM数据库中搜索抗疲劳靶点，采用Cytoscape 3.6.0软件构件黄芪活性成分-抗疲劳靶点网络；使用String数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用分析，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，通过度值（degree）筛选关键靶点并进行归属；使用DAVID数据库对黄芪抗疲劳作用靶点进行基因本体（GO）富集分析和KEGG通路富集分析，以探究黄芪抗疲劳的作用机制。
结果 获得黄芪中11种活性成分，包括毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、异黄烷、紫檀烷6种黄酮类成分，黄芪皂苷I、II、III、IV 4种皂苷类成分及蔗糖。黄芪抗疲劳作用预测靶点有76个，网络分析结果表明，黄芪主要涉及一氧化氮的生物合成、过氧化氢反应、棕色脂肪细胞分化的正调节、活性氧代谢等生物过程，通过调节癌症通路，FoxO、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）、低氧诱导因子-1（HIF-1）、血管内皮生长因子（VEGF）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Ca2+信号通路、氧化应激反应等来发挥抗疲劳作用。
结论 本研究体现了黄芪多成分-多靶点-多途径的作用特点，为进一步开展黄芪抗疲劳作用机制的研究提供了新思路和新方法。
疲劳首见于《金匮要略》[1]，随着现代生活节奏加快和社会竞争激烈，疲劳已经成为普遍的问题。疲劳是一种常见而又复杂的症状，生理性疲劳是由大量运动导致体内代谢物累积引起，如果不能及时消除，随着运动强度和运动量的增大，会出现情绪变化、身体不适、脾胃症状和津液损失，表现出亚健康疲劳，这种状态的进一步发展必将导致五脏机能失调、精气血耗损，出现慢性疲劳综合症[2]。世界上约有10%的人患有慢性疲劳[3]，然而其发病机制并不完全明确。有研究表明，疲劳的产生可能与能量代谢、免疫和内分泌系统及抗氧化防御系统的炎症反应和功能障碍有关[4-6]。
黄芪，始载于《神农本草经》，列为上品[7]，为豆科植物膜荚黄芪Astragalusmembranaceus (Fisch.)Bge. 或蒙古黄芪A. membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicusBge. Hsiao的干燥根，归肺、脾经，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津止血等功效，用于气虚乏力、食少便溏、中气下陷、气虚水肿等[8]。黄芪中主要成分包括黄酮类、皂苷类、糖类、有机酸类、氨基酸类等[9]。传统中医认为黄芪是补气良药，素有“十药八芪”之称，文献研究表明，黄芪具有显著的抗疲劳[10]、抗炎[11]、抗免疫[12]等作用，但其作用的分子机制不十分明确。因此，借助网络药理学的方法挖掘黄芪抗疲劳作用的靶点与通路，从微观角度科学论证黄芪抗疲劳的作用机制有重要意义。
网络药理学融合了系统生物学、多向药理学、计算生物学、网络分析等多学科的技术和内容，进行“疾病-表型-基因-药物”多层次网络的构建，从整体的角度探索药物与疾病间的关联性，具有整体性、系统性的特点，特别适用于多成分、多靶点、多途径的中药药效机制和物质基础研究[13-15]。本课题组前期研究通过力竭游泳及限制饮食复制疲劳大鼠模型，给予黄芪后疲劳大鼠力竭游泳时间、血清生化指标、病理切片、肌肉代谢组学等结果均显示黄芪有明显的抗疲劳效果。因此，本研究以课题组发现的黄芪中主要的初级、次级代谢产物糖类、黄酮类、皂苷类成分为研究对象，采用网络药理学方法阐释黄芪发挥抗疲劳药效的作用机制，为后续实验提供理论依据。
1 方法
1.1 黄芪化学成分数据库的构建
本课题组前期从黄芪中指认出12种次级代谢成分以及氨基酸、有机酸、糖等多种初级代谢成分，结合中医药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/，Version 2.3）获取黄芪的化学成分，并依照实验室建立的方法[16]对其中的成分进行含量测定。
1.2 化合物分子结构的构建
将上述黄芪活性成分在Chembiodraw Ultra 12.0软件中绘制出结构图，并以mol2格式存储。利用PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、TCMSP、ChemSpider（http://www.chemspider.com）、Chemical Book（http://www.chemicalbook.com/）对其分子结构进行确证。
1.3 黄芪活性成分作用靶点的预测和筛选
将“1.2”项下得到的11个化合物分子结构的mol2格式文件导入到PharmMapper，选取黄芪的潜在作用靶点。利用UniProt数据库的UniProt KB（https://www.uniprot.org/uniprot/）搜索功能，导入黄芪蛋白靶点的PDB ID号，限定物种为人，经检索和转化操作得到黄芪活性成分的基因靶点。下载每个成分反向对接预测结果，将对接得分（Z）值按照降序排列，选取每个成分的前300个靶点用于后续研究。
1.4 抗疲劳靶点筛选
通过在GeneCards数据库（http://www. genecards.org/，Version 4.5.0）和OMIM数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）中输入关键词fatigue、anti-fatigue，搜索已报道的与疲劳相关的基因，去除重复基因和假阳性基因，与上述作用靶点进行匹配，搜集黄芪活性成分抗疲劳的潜在作用靶点。
1.5 活性成分-抗疲劳作用靶点网络构建
将黄芪活性成分和抗疲劳作用靶点筛选结果，去除无对应靶点的化学成分，并删除重复的靶点。将数据导入Cytoscape Version 3.6.0软件，构建黄芪活性成分-抗疲劳作用靶点网络。Cytoscape软件的核心架构是网络，每个节点（node）是基因、蛋白质或分子，节点与节点之间的连接（edge）代表这些生物分子之间的相互作用，节点的度值（degree）代表网络中节点与节点相连的数目，度值越大，这个靶点越有可能成为化合物的关键作用靶点。
1.6 蛋白相互作用网络构建与分析
String数据库（https://string-db.org/，Version 10.5）是一种包含已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用的数据库。将黄芪的蛋白靶点导入String数据库，限定物种为人，获取蛋白相互作用关系，结果保存成TSV格式，保留文件中node1、node2和Combinedscore信息并导入Cytoscape软件绘制相互作用网路，并对网络进行分析（Cytoscape→Tools→ Networkanalyzer→Networkanalysis→Analyzenetwork），保存网络分析结果，使用Cytoscape中的Generate style from statistics工具（Cytoscape→Tools→Networkanalyzer→Networkanalysis→Generate style from statistics）将节点大小和颜色设置用于反映度值的大小，边的粗细设置用于反映结合率评分（Combine score）的大小，获得最终的蛋白相互作用网络。
1.7 作用靶点类型归属
DisGeNET 数据库（http://www.disgenet.org/ web/DisGeNET/menu，Version 5.0）是包含与人类疾病相关的基因和变体的平台之一。在DisGeNET数据库中选用基因进行检索，将上述黄芪的作用靶点依次导入数据库中，获取靶点类型信息（Protein Class）。
1.8 生物过程与通路分析
生物学信息注释数据库（DAVID，https:// david.ncifcrf.gov/summary.jsp，Version 6.8）为大规模的基因或蛋白提供系统综合的生物功能注释信息，能够找出最显著富集的生物学注释。将黄芪的作用靶点导入DAVID数据库，SelectIdentifier设置为OFFICIAL GENE SYMBOL，List Type设置为GeneList，限定物种为人，对黄芪作用靶点进行基因本体（GO）分析和KEGG通路分析，保存结果。设定阈值P＜0.05，并按照涉及的靶点数目多少进行排序，筛选排名靠前的生物过程或通路。
1.9 通路图绘制
利用UniProt数据库的UniProt KB搜索功能分别获取黄芪76个抗疲劳靶点的UniprotID。利用KEGG数据库（http://www.kegg.jp）KEGG mapping中的KEGG Mapper工具，将上述黄芪关键靶点的UniProt ID导入，限定物种为人，获取黄芪抗疲劳作用的通路图，筛选排名靠前的几条通路并进行整合绘制最终的通路图。
2 结果
2.1 黄芪活性成分的筛选
本研究结合实验室前期工作共筛选到11种黄芪活性成分（表1），包括6种黄酮类成分毛蕊异黄酮葡苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花黄素、黄芪异黄烷苷、黄芪紫檀烷，4种皂苷类成分黄芪皂苷I、黄芪皂苷II、黄芪皂苷III、黄芪皂苷IV以及蔗糖。
2.2 黄芪活性成分-抗疲劳作用靶点预测
将PharmMapper、Chemmapper数据库得到的所有靶点，删除重复并去除假阳性，整合后得到11种活性成分靶点231个，由GeneCards、OMIN数据库检索整合得到疲劳/抗疲劳靶点861个，将黄芪活性成分对应靶点与疲劳相关靶点取交集得到活性成分-疾病靶点76个，具体信息见表2。
2.3 活性成分-作用靶点网络构建
使用Cytoscape软件构建活性成分-抗疲劳作用靶点网络图，如图1所示，共有87个节点，166条边，其中黄色表示6个黄酮类成分，绿色表示4种皂苷类成分，蓝色表示蔗糖，粉色表示这些活性成分对应的抗疲劳作用相关靶点。边代表活性成分与抗疲劳靶点的相互作用。分析结果显示11种活性成分分别对应11、14、17、10、19、14、19、15、22、16、9个靶点。从韦恩图（图2）中可以看出，黄酮类成分作用靶点40个，皂苷类成分作用靶点35个，糖类成分作用靶点9个，其中黄酮类和皂苷类成分共同作用靶点16个，黄酮类成分与蔗糖共同作用靶点4个，皂苷类成分与蔗糖共同作用靶点3个，3类成分共同作用靶点只有1个。基质金属蛋白酶2（MMP2）、维生素D受体（VDR）、E3泛素蛋白连接酶（TRIM21）、过氧化氢酶（CAT）、肌红蛋白（MB）、胆碱激酶β（CHKB）等与化学成分关联度较大，分别与8、7、6、6、5、5个活性成分相关联。每个活性成分可作用于多个靶点，每个靶点也与多个化合物相关，这说明黄芪在发挥药效作用时不同化合物具有共同的作用。
2.4 蛋白相互作用网络构建与分析
如图3所示，图中节点表示蛋白，边表示蛋白之间的关联，共涉及71个节点，367个边。度值越大，节点越大，在整个网络中占的地位越大，通过计算每个节点的拓扑性质寻找黄芪抗疲劳作用的关键靶点，在蛋白相互作用网络中筛选出的度值排名靠前的靶蛋白在黄芪抗疲劳过程中发挥着重要作用。最后选择21个度值≥15，介数中心性≥0.020479，中心接近度（closeness）≥0.555555的节点作为主要节点，并将关键靶点依次导入DisGeNET数据库，获取靶点对应的类型，主要信息见表3。结果表明黄芪抗疲劳过程中有胰岛素、信号转导因子、凝血因子II、神经细胞黏附分子、受体（过氧化物酶体增殖物激活受体、雌激素受体）、蛋白（膜联蛋白、肿瘤蛋白p53、微球蛋白、热休克蛋白等）、酶（过氧化氢酶、酪氨酸激酶、一氧化氮合酶、聚合酶、蛋白酶、血红素加氧酶I、凝血酶）等物质的参与。
2.5 基因功能与通路分析
对筛选得到的21个关键靶点进行GO分析和KEGG通路分析。GO富集分析包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组分（cellularcomponent，CC）3个分支。设定阈值P＜0.05，共富集到134条生物过程或通路，筛选靠前的生物过程或通路，用GraphPadPrism 5.0绘图，见图4～7。
如图4所示，这些靶点主要涉及一氧化氮（NO）的生物合成过程（positiveregulation of nitric oxide biosynthetic process）、过氧化氢反应（response to hydrogen peroxide）、棕色脂肪细胞分化的正调节（positive regulation of brown fat cell differentiation）、活性氧代谢过程（positive regulation ofreactive oxygen species metabolic process）等生物过程。疲劳产生的原因一部分是由于机体能量供应不足，线粒体产生机体中几乎所有的能量和热，NO为一种血管扩张剂，可以刺激新的线粒体的合成，能直接调控氧与血红素的结合与释放，而且以这种方式控制对线粒体的氧的供给，从而发挥抗疲劳的作用[17]。黄芪总皂苷抗运动性疲劳作用可能与其抑制运动氧化应激所致的自由基增加和改善海马神经元损伤有关[18]。
MF分析（图5）中可以看出，靶点主要涉及蛋白质结合（protein binding）、酶结合（enzymebinding）、血红素结合（heme binding）、蛋白磷酸酶结合（protein phosphatase binding）等分子功能。血红素加氧酶-1（HO-1）是一种诱导性限速酶，它有助于抑制炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-6的产生，并且已经成为调节炎症反应和各种疾病中的氧化应激关键分子[19]。
CC分析（图6）可以看出，靶点主要涉及细胞质（cytoplasm）、核（nucleus）、膜（membrane）、细胞外分泌物（extracellular exosome）。核转录因子E2相关因子2（Nrf2）通常存在于细胞质中，Wang等[20]指出药物抗疲劳可能与Nrf2介导的氧化应激有关。
KEGG通路分析结果（图7）显示，黄芪抗疲劳靶点主要涉及FoxO信号通路（5个靶点/23%）、癌症相关通路（7个靶点/33%）、低氧诱导因子（HIF-1）信号通路（4个靶点/19%），过氧化物酶体（3个靶点/14%）等信号通路。说明黄芪主要活性成分的作用靶点分布在不同的代谢通路，多成分、多靶点相互调节是抗疲劳的可能作用机制。
2.6 靶点通路分析
利用KEGG Mapper工具获取黄芪抗疲劳的通路图，将KEGG得出的前10条通路整合绘制通路图（图8）。图中箭头表示促进作用，T-箭头表示抑制作用，不同颜色箭头表示不同的通路。通路靶点标记为蓝色，黄芪抗疲劳靶点标记为粉色。图中显示出黄芪抗疲劳作用主要涉及了癌症通路、FoxO、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）、HIF-1、血管内皮生长因子（VEGF）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Ca2+信号通路、氧化应激反应、DNA修复过程等，涉及10个黄芪抗疲劳靶点（占黄芪抗疲劳关键靶点的49%）。提示黄芪抗疲劳靶点位于这几条通路中，通过调节其中的几个环节发挥作用，绝大多数靶点在多条通路中发挥作用，如PI3K、Akt等。
3 讨论
黄芪作为补气良药，有明显的抗疲劳作用，然而其作用机制尚不明确。网络药理学与中医药整体
观的思想基本一致，有助于系统全面地阐释黄芪抗疲劳的作用机制。本研究以课题组前期指认出的主要初级、次级代谢成分作为活性成分，共筛选得到毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、异黄烷、紫檀烷、黄芪皂苷I、II、III、IV以及蔗糖共11种活性成分，包括6种黄酮类、4种皂苷类以及蔗糖。有研究表明，黄芪皂苷明显提高运动性疲劳大鼠骨骼肌的过氧化物酶（POD）水平、总抗氧化能力（T-AOC）和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，降低乳酸脱氢酶（LDH）的含量，具有保护运动性疲劳大鼠肌组织的作用[21]。黄芪中黄酮类成分与一些其他类成分（包含皂苷类）指纹图谱色谱峰对抗疲劳呈增强作用[22]。黄芪多糖可延长小鼠负重力竭游泳时间，降低机体血乳酸的积累，增加肝糖原的储备，起到延缓疲劳发生/提高运动能力的作用，能提高小鼠肝组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性，具有抗氧化损伤作用，能保护运动诱导的氧化应激[23]。
活性成分-作用靶点网络显示了黄芪抗疲劳多成分、多靶点的特点，蛋白相互作用网络表明黄芪的靶蛋白之间存在着相互关系，是一个复杂交错的网络，并非单独发挥作用。本研究结果表明11种活性成分均具有抗疲劳作用，其中黄芪皂苷I、III及毛蕊异黄酮葡萄糖苷、异黄烷连接较多靶点数。胰岛素（INS）、IL-10、TP53、CAT等度值较大，是黄芪抗疲劳的主要作用靶点，预测其在黄芪抗疲劳活性中发挥主要作用。INS、CAT是黄酮类和皂苷类化合物的主要作用靶点，INS是多功能的蛋白质激素，对糖、脂肪和蛋白质的代谢起着重要的调节作用[24]。较高的CAT活性有较高的抗氧化功能，可以及时清除体内自由基，减轻过氧化对机体组织细胞的损害和促进疲劳的恢复[25]。IL-10、TP53是蔗糖的主要作用靶点，IL-10是要由Th2细胞所产生的一种细胞因子，是以抑制Th细胞克隆细胞因子合成为特点的多效免疫调节因子，对运动性疲劳的恢复有重要作用[26]。P53是一种肿瘤抑制基因，它所介导的细胞信号转导途径在调节细胞正常生命活动中起重要作用，有研究表明，通过抑制大鼠骨骼肌p53蛋白的表达，可减少运动所引起的肌肉细胞凋亡的发生[27]。
富集分析和靶点归属分析结果表明，黄芪抗疲劳涉及细胞过程、代谢过程和对应激的应答等生物过程，涉及细胞器、细胞膜和细胞质等细胞组分，涉及小分子、阳离子、金属离子等分子，有信号分子、转录因子、受体、蛋白和酶等多种物质的参与，是一个复杂的过程。
从通路中可以看出，黄芪抗疲劳主要涉及癌症通路、FOXO、Nrf2、HIF-1、MAPK、PI3K/Akt、VEGF、Ca2+、腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）/p53及insulin信号通路，涉及氧化应激、DNA修复、细胞增殖、活性氧（ROS）解毒等反应。有研究表明FoxO转录因子作为Fox家族主要成员，是胰岛素/胰岛素样生长因子（INS/IGF-1）信号通路中的关键因子，通过转录调控和信号转导途径在动物的生理调节、代谢和细胞周期等方面起重要作用[28]。Hribal等[29]发现，在成肌细胞c2c12中，通过siRNA抑制Foxol的表达来增加肌浆球蛋白的表达有利于肌细胞分化；在依赖于Akt的肌浆蛋白生成过程中，FoxO1蛋白发挥关键作用，提示黄芪可以通过FoxO通路影响疲劳大鼠的肌肉分化从而缓解疲劳。Nrf2是转录水平细胞氧化的关键调节因子，它直接控制SOD、HO-1和CAT的浓度。HO-1有助于将血红素转化为胆红素，胆红素是一种有效的抗氧化剂。当ROS过度积累时，Nrf2被激活并积聚在细胞质中。通过改善体内Nrf2的活性，可以有效地预防氧化应激损伤，从而缓解疲劳[20]。HIF-1是低氧条件下组织细胞产生的一种核蛋白，用于维持氧稳态的关键物质，它与其下游靶基因结合，使得机体低氧耐受能力增强。运动会导致机体组织细胞的运动性缺氧，骨骼肌中HIF-1α蛋白含量与基因表达会上升[30]。MAPK信号系统在机体对环境应激适应及维持机体内氧化抗氧化动态平衡状态中发挥着重要的作用。有研究表明[31]，黑果枸杞子可以有效缓解过度训练导致的机体内环境失衡，提高机体尤其是骨骼肌的氧自由基清除能力，抑制MAPK信号通路的蛋白表达，预防和延缓运动疲劳的发生与发展。PI3K在磷酸激酶家族中的占有重要地位，它可以调节细胞的生长、凋亡，Akt是丝氨酸/苏氨酸激酶，是PI3K下游最主要的效应分子之一。任增辉[32]研究发现大强度递增负荷训练会使大鼠海马组织中PI3K、Akt蛋白及mRNA表达水平上升，能够说明大强度递增负荷运动能够激活PI3K/Akt信号转导通路，发挥其抗凋亡作用。AMPK是细胞能量代谢中的关键调节蛋白，AMPK激活可调节细胞凋亡[33-34]。AMPK活化导致p53的积累从而诱导肌肉组织细胞凋亡，通过抑制AMPK/p53信号通路可以抑制肌肉组织细胞的凋亡，减少组织细胞损伤，从而缓解肌肉疲劳。INS是糖与脂肪能量代谢过程中主要的调控激素。INS首先与细胞表面胰岛素受体（INSR）结合，激活其β亚基的蛋白酪氨酸激酶（PTK）。胰岛素受体底物蛋白（IRS）作为一种锚定蛋白可以激活至少2条已知信号途径：一是通过IRS激活PI3K途径；另一条是通过生长因子受体结合蛋白2（Grb2）/SOS和RAS蛋白活化MAPK途径[35]。
综上所述，本研究结果显示黄芪的11个活性成分作用于76个靶点，涉及多种过程、分子和通路，体现了黄芪多成分-多靶点-多途径的作用特点。通过蛋白相互作用网络预测了黄芪抗疲劳作用的21个重要靶蛋白，并对关键靶点作用进行归属，绘制通路图，通过文献调研对各条通路进行验证，但还应进一步对相关靶点进行实验验证。
参考文献（略）
来 源：张 瑞，曹庆伟，李爱平，刘月涛，李 科，秦雪梅. 基于网络药理学的黄芪抗疲劳作用机制研究 [J]. 中草药, 2019, 50(8):1880-1889.
