血细胞的生成是多能造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）在特定造血微环境的网络调控下，增殖分化成各种成熟血细胞的动态平衡过程。人类HSCs主要存在于骨髓内，外周血中也含有少量的HSCs。HSCs具有高度自我更新和增殖的能力，可以分化成各种血细胞的前体细胞（如造血祖细胞），然后在造血微环境的作用下再定向增殖分化成为各种原始和成熟血细胞，最后，这些成熟的血细胞由骨髓进入血液，完成造血[1]。由于骨髓HSCs分化程度低，增殖活性高，对化疗药物、辐射等因素敏感，因而，化疗药物、辐射易损伤HSCs、造血祖细胞和骨髓造血微环境，引起骨髓抑制[2-3]。多种原因引起的骨髓造血功能抑制与HSCs密切相关，HSCs衰老导致的功能抑制是引起造血功能障碍的主要原因。因此，深入研究HSCs衰老的机制对防治造血功能低下相关疾病有重要的科学意义，改善HSCs衰老为造血功能低下防治的重要策略。
黄芪和当归的配伍应用最有名的是由李东垣所创的黄芪、当归配比为5∶1的当归补血汤，由黄芪一两、当归二钱组成，主治气虚发热之证。现代以当归补血汤治疗多种贫血和造血功能低下有较好疗效。以往研究表明，黄芪和当归配伍可增加骨髓有核细胞数和血中造血生长因子（HGF）水平，抑制HSCs衰老和促进其增殖[4-5]，升高外周血像[6-7]，其中以黄芪和当归1∶1配伍的促造血作用最强。进一步以HSCs衰老模型研究发现，黄芪-当归1∶1配伍可促进衰老HSCs增殖，促进细胞周期转换[8]。唐蓉等[9]研究表明，黄芪-当归1∶1配伍时由小肠吸收的主要成分是阿魏酸、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷和芒柄花素5种活性成分。由于中药多是通过口服给药吸收后进入体内发挥作用，因此，推测此5种活性成分可能为其促造血作用的主要药效物质。但是，这5种成分配伍能否发挥黄芪、当归配伍时的功效，其促造血的作用机制是什么，这些问题尚未阐明。本实验采用HSCs衰老模型，研究黄芪和当归的主要活性成分配伍对衰老HSCs增殖的影响，以明确其促造血作用的主要药效物质，为其合理应用提供科学依据。
（实验过程略）
讨论
HSCs是机体造血系统的种子细胞，具有很强的多向分化和自我更新潜能[1]。HSCs及祖细胞增殖、分化是血细胞正常发育成熟、维持正常造血功能的基础。机体衰老或者在放疗、化疗条件下均会引起HSCs老化，HSCs老化的显著特征是自我更新和增殖能力降低，表现为衰老的HSCs向骨髓归巢能力下降，自我更新能力减弱和分化功能异常，细胞增殖周期阻滞，出现明显延迟的增殖反应，从而表现出贫血、免疫功能衰退等造血系统衰老的特征性表现和肿瘤发生率增加、组织器官损伤难以修复等[10-11]。化疗、放疗和活性氧类（ROS）等多种因素是引起HSCs衰老和细胞周期停滞的重要原因。目前认为，HSCs老化的产生与多种机制有关，其中p53/p21信号通路发挥了重要的作用。在应激条件下（如DNA损伤、缺氧和感染等）激活p53，导致p21高表达，p21能抑制细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）激活，引起细胞周期停止；上调p14 ARF或nutlin-3引起p53激活和p21高表达可导致细胞老化[12]。SA-β-Gal染色是鉴定细胞衰老的重要方法，且该方法仅会染色衰老细胞，而衰老前细胞、静止期细胞以及肿瘤细胞都不会着色，其实验结果较可靠，不易被其他杂系细胞所干扰[13]。
以往采用血浆药理学方法，研究了黄芪、当归配伍对衰老HSCs增殖的影响，结果表明，10%的黄芪-当归配伍含药血浆可显著促进HSCs增殖，而且以黄芪-当归1∶1配伍的作用较强，其机制与调节细胞周期有关[8]。大鼠肠吸收实验研究表明[9]，黄芪-当归1∶1时肠吸收主要成分是阿魏酸、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷和芒柄花素5种活性成分。因此，在本实验中，为进一步比较有效成分配伍是否具有黄芪-当归1∶1配伍相似的促HSCs增殖的作用，设立了黄芪-当归1∶1配伍含药血浆，并与空白血浆进行比较，探讨含药血浆和有效成分配伍作用的异同。
本实验结果表明，黄芪、当归活性成分阿魏酸、黄芪甲苷和芒柄花素可呈剂量依赖性地促进衰老HSCs增殖和延缓HSCs衰老，为黄芪、当归抗HSCs衰老和促进细胞增殖的主要活性成分。而毛蕊异黄酮在2.5～40.0 μg/mL、毛蕊异黄酮苷在1.25～20.00 μg/mL时对衰老HSCs无显著促增殖和降低细胞衰老率的作用。但正交试验研究表明，毛蕊异黄酮或毛蕊异黄酮苷与阿魏酸、黄芪甲苷、芒柄花素联合使用时，可显著促进衰老的HSCs增殖，降低细胞衰老率。表明毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷单独应用虽无促HSCs增殖和降低细胞衰老的作用，但与3个主要有效成分配伍后可增强主要活性成分促细胞增殖和降低细胞衰老的作用，5种成分配伍后对促进细胞增殖和抑制细胞衰老具有增效的作用。
在细胞周期中，细胞周期G1期是细胞衰老的关键期间，也是对其衰老控制的关键控制点。因此，通过对G1期进行调控，可改善细胞衰老。CDK4是细胞周期调控的核心[14]，Cyclin D1为正性调节因子，细胞周期依赖性激酶抑制物（CKI）为负性调节因子[15]。P16是CKI家族中的调节因子，在G1期关键控制点发挥重要作用，其机制是能与CDK4进行特异性结合，阻止Cyclin D1/CDK4复合物的形成，导致Rb蛋白磷酸化水平降低，使细胞不可逆的停滞于G1期。Cyclin是调控细胞周期的重要因素之一，它作用于细胞周期的不同阶段，引起细胞分裂、增殖，加速细胞周期进程。在Cyclin家族中，Cyclin D在细胞G1/S转换点中发挥着重要的作用，其中Cyclin D1是G1期的特异性表达蛋白，通过加速G1期的进程而缩短细胞周期[16]。CDK处于细胞周期调控网络中的中心地位，受细胞周期蛋白影响，CDK主要是通过与周期蛋白结合而正向调节细胞周期进程。不同的Cyclin识别并结合不同的CDK，组成不同的Cyclin-CDK复合体，其中CDK4与Cyclin D1结合，可通过将Rb蛋白磷酸化而使Rb蛋白失去对细胞周期的阻滞作用，从而实现对细胞周期的推动和转化。本实验结果表明，与对照组比较，模型组和空白血浆组静止期（G0/G1期）细胞显著增多，增殖期（G2/M＋S期）细胞显著减少，CyclinD1和CDK4蛋白表达显著降低。表明HSCs衰老时细胞周期蛋白表达下调，使细胞周期进展阻滞。与模型组比较，阿魏酸、芒柄花素、黄芪甲苷、活性成分配伍均可使G0/G1期细胞显著减少，G2/M＋S期细胞显著增加，Cyclin D1和CDK4蛋白表达显著增强。与空白血浆组比较，黄芪-当归1∶1配伍含药血浆组的G0/G1期细胞也显著减少，G2/M＋S期细胞显著增加，CyclinD1和CDK4蛋白表达显著增加。与活性成分配伍组比较，各活性成分单用组的G0/G1期细胞增多，G2/M＋S期细胞减少，Cyclin D1和CDK4蛋白表达均显著降低。而含药血浆组与活性成分配伍组比较无显著差异。表明阿魏酸、黄芪甲苷、芒柄花素为黄芪当归配伍促HSCs增殖的主要药效物质，而次要成分毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷与主要成分配伍后可增强五种成分配伍后促HSCs增殖的作用，黄芪当归1∶1配伍与5种活性成分配伍具有相同的促HSCs增殖的作用。这些结果说明，主要成分阿魏酸、黄芪甲苷、芒柄花素和主要成分与次要成分毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷配伍，以及黄芪、当归配伍均能增加Cyclin D1和CDK4表达，从而促进了CyclinD1/CDK4复合物的形成，促进了HSCs由G1期进入S期，实现对细胞周期的推动和转化。
本研究结果表明，黄芪和当归1∶1配伍和其5种主要活性成分阿魏酸、黄芪甲苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷配伍均可改善HSCs衰老，缩短细胞周期，促进HSCs增殖。5种活性成分配伍具有增效作用。这可能是不同活性成分作用于HSCs增殖的不同环节，从而发挥增效作用。
参考文献（略）
来 源：朱嘉欢，黄小平，邓常清. 黄芪和当归的主要活性成分配伍促进衰老造血干细胞增殖作用的研究 [J]. 中草药, 2019, 50(1):111-119.
