2021-12-24艾叶中主要化学成分的鉴定及其含量测定研究

摘  要：目的  鉴定艾叶Artemisiae Argyi Folium中主要化学成分的结构并建立其含量测定方法。方法  利用UPLC-UV-Q/TOF进行艾叶分析条件的优化，在对21批艾叶分析的基础上，确定其中紫外和质谱上主要的色谱峰，利用精确相对分子质量和碎片离子鉴定其结构后，利用对照品比对确定结构；进一步采用WatersAcquity I-Class^TM液相色谱系统，WatersAcquity HSS T3色谱柱（100 mm×2.1mm，1.8 μm），乙腈-0.2%磷酸水为流动相，体积流量0.5mL/min，梯度洗脱，柱温40 ℃，PDA检测器，检测波长为326nm，建立艾叶中主要化学成分的含量测定方法。结果  推测鉴定了艾叶中32个主要化合物的结构，利用对照品确定了其中15个化合物的结构，并建立了其中14个化合物（绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、咖啡酸、夏佛塔苷、芹菜素、高车前素、棕矢车菊素、异泽兰黄素、5,7,3′-三羟基-6,4′,5′-三甲氧基黄酮、蔓荆子黄素）的UPLC-UV含量测定方法。14个化合物的分离度良好，稳定性和重复性良好，且线性范围宽（0.5～800.0μg/mL）、线性较好（R²＞0.999），平均回收率在94.88%～103.58%。结论  建立的艾叶中14个主要化合物的含量测定方法可以全面评价艾叶的质量。

 

 

 

 

 

艾叶ArtemisiaeArgyi Folium为菊科蒿属植物艾Artemisiaargyi Lévl. et Vant.的干燥叶，其性辛、温，味苦，归肝、脾、肾经，具有温经止血、散寒止痛的功效，主要治疗吐血、衄血、崩漏、月经过多、胎漏下血、少腹冷痛、经寒不调、宫冷不孕等疾病，外用可以祛湿止痒^[1]。现代药理研究表明，艾叶具有抗菌、抗病毒、平喘镇咳、祛痰、抗氧化、止血、抗凝血、护肝利胆、解热镇静、调血脂等作用^[2-4]。艾叶目前主要作为加工艾绒的材料用来灸疗，灸疗时的热和芳香性气味是发挥药效的关键^[5]，所以大家更为关注其挥发性成分及燃烧后的艾烟等^[6-9]。艾叶作为中药配伍，汤剂也是其主要用途，所以非挥发性成分也应是艾叶中需关注的化学成分。文献研究表明，绿原酸类、黄酮类及萜类等为其主要成分^[10-13]，且这些成分具有良好的药理活性^[14-18]。《中国药典》2020年版中虽然以挥发油类成分作为艾叶的质控指标，但笔者认为挥发性成分和燃烧学特征对艾绒（艾条）的质控较为关键^[19-21]，以非挥发性成分为指标进行艾叶的质控更为客观。一些学者进行了艾叶中绿原酸和黄酮类成分的含量测定研究^[22-25]，为艾叶的质量研究进行了有益探索。本研究采用UPLC- UV-Q/TOF MS串联分析了21批艾叶，在确定艾叶紫外和质谱上共有色谱峰的同时，利用精确相对分子质量和质谱裂解规律推测了共有峰的结构，并利用对照品确定了15个化合物的确切结构，进一步建立了这14个化合物的含量测定方法，为艾叶的质量评价和控制研究提供了合理可控的方法。

1  仪器与材料

Waters Acquity I-Class UPLC^TM液相色谱仪串联（包括二元高压溶剂管理器、自动进样器、柱温控制系统、PDA检测器、Empower 3工作站）Waters Xevo G2-S高分辨质谱系统（美国Waters公司）。色谱柱为Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm）和BEH C₁₈色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。Mettler Toledo XS105DU分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司），离心机（Eppendorf公司，德国），超声波清洗器（SB-800 DTD，宁波新芝生物科技股份有限公司）。甲醇（色谱纯，UN1230）和乙腈（色谱纯，UN1648）购自德国默克股份有限公司，超纯水为超纯水系统自制（ThermoBarnstead Gen Pure UV/UF，美国赛默飞公司）。

对照品新绿原酸（批号906-33-2）、绿原酸（批号327-97-9）、隐绿原酸（批号905-99-7）、咖啡酸（批号331-39-5）、夏佛塔苷（批号51938-32-0）、异夏佛塔苷（批号52012-29-0）、异绿原酸B（批号14534-61-3）、异绿原酸A（批号2450-53-5）、异绿原酸C（批号32451-88-0）、芹菜素（批号520-36-5）、山柰酚（批号520-18-3）、高车前素（批号1447-88-7）、棕矢车菊素（批号18085-97-7）、5,7,3′-三羟基-6,4′,5′-三甲氧基黄酮（批号78417-26-2）、异泽兰黄素（批号22368-21-4）、蔓荆子黄素（批号479-91-4）质量分数均≥98%，购自于北京融诚鑫德科技发展有限公司。

艾叶主要采自于湖北、河南、湖南等地，经黄显章教授鉴定为菊科蒿属植物艾A. argyi Lévl. et Vant.的干燥叶，具体样品信息见表1。

2  方法与结果

2.1  色谱和质谱条件

UPLC-UV分析，流动相为0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脱：0～0.2 min，5% B；0.2～0.8 min，5%～10% B；0.8～3.5 min，10%～13% B；3.5～4 min，13%～15% B；4～10 min，15%～18% B；10～10.5 min，18%～19% B；10.5～15.5 min，19%～21.2% B；15.5～19.5 min，21.2%～32% B；19.5～22.5 min，32%～55% B；22.5～23 min，55%～98% B；23～25 min，98% B；25～27 min，5% B；体积流量0.5 mL/min，Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），检测波长326 nm，柱温40 ℃，进样量1 μL。色谱图见图1-A。

UPLC-UV-Q/TOFMS分析的流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脱，0～0.3 min，2%～5% B；0.3～1.0 min，5% B；1.0～7.0 min，5%～20% B；7.0～9.0 min，20% B；9.0～9.5 min，20%～25% B；9.5～12.5 min，25%～28% B；12.5～18.0 min，28%～40% B；18.0～18.3 min，40%～80% B；18.3～21.0 min，80%～98% B；21.0～24 min，98% B；体积流量为0.5 mL/min，Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），PDA检测器，柱温40 ℃，进样量1 μL。质谱采用ESI负离子模式，MS^E采集模式。毛细管电压为2000 V，锥孔电压为40 V，除溶剂气体为氮气，900L/h，除溶剂温度为450℃，离子源温度为100℃，扫描范围为m/z 50～1200，碰撞气体：氩气。低能量扫描时trap电压为6eV，高能量扫描时trap电压为50～70eV。准确质量数用亮氨酸脑啡肽作校正液（554.2620）。MassLynx为操作系统，质谱图见图1-B。

2.2  对照品溶液的制备

分别精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、夏佛塔苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、芹菜素、高车前素、棕矢车菊素、5,7,3′-三羟基-6,4′,5′-三甲氧基黄酮、异泽兰黄素、蔓荆子黄素，加入色谱甲醇超声溶解后，转移至量瓶配制成质量浓度依次为0.77、0.768、0.798、0.77、0.818、0.79、0.824、0.766、0.758、0.808、0.742、0.776、0.782、0.800 mg/mL的混合对照品母液，并逐级稀释成10个质量浓度，待用。

2.3  艾叶样品溶液的制备

精密称取不同艾叶样品各200mg，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%的甲醇10 mL，称定质量，超声提取60 min，放置室温后，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，12 000×g离心15 min，取每个样品的上清液经0.22 μm有机微孔滤膜过滤，续滤液转移到液相小瓶待定量分析。分别取相同量的21个样品溶液混合后作为质控的混样备用。

2.4  艾叶样品的UPLC-UV-Q/TOF MS分析

通过混合样品的UV和MS图谱，可以紫外和质谱图上标示出主要共有的26个色谱峰（峰1～26），另外质谱上还有响应较高的6个色谱峰在紫外色谱图上基本没有色谱峰（M1～M6），见图1。为了推测鉴定这32个化合物的结构，首先通过分析这些色谱峰的精确相对分子质量、碎片离子峰及其相对丰度、保留时间等信息并参考文献^{[4,11-12,26-28]}，推测了它们可能的结构，主要是绿原酸和黄酮类化合物，然后购买了16个对照品进行质谱和色谱的比对，最终确定了15个化合物的结构，推测了11个化合物的结构，还有6个化合物缺少碎片信息没有鉴定可能的结构，各化合物具体LC-MS数据见表2。

绿原酸类化合物均有m/z 191.05 [奎宁酸–H]^–的碎片，多有m/z 179.03 [咖啡酸–H]^–，173.04 [191.05–H₂O]^–、161.02 [179.03–H₂O]^–、135.04 [179.03–CO₂]^–的离子。咖啡酰基在奎宁酸上的取代位置不一样，其在质谱上碎片离子稍有差异，而且相互之间的离子丰度具有显著差异：奎宁酸4位有咖啡酰基取代时，m/z 173.04的离子丰度较m/z 161.02、179.03、191.05高，3位取代时基本只有m/z 191.05的离子碎片，5位取代时m/z 179.03、191.05的离子碎片丰度均较高。

10.98 min的色谱峰显示m/z 677.150 5 [M–H]^–的准分子离子峰，说明这是个3咖啡酰基奎宁酸的化合物，m/z 515.119 0 [M–H–C₉H₆O₃]^–，353.083 0 [M–H–2C₉H₆O₃]^–，191.050 8 [M–H–3C₉H₆O₃]^–分别为分子离子峰连续脱3个咖啡酸的离子碎片，其m/z 191.050 8、179.029 3、173.040 5、161.018 2的碎片丰度相当，判断奎宁酸有4位取代，推测该化合物可能为3,4,5-三咖啡酸奎宁酸。

黄酮碳苷中显示[M–H–H₂C₂O₂]^–，[M–H–H₃C₃O₃]^–，[M–H–H₄C₄O₄]^–的碎片离子，分别为分子离子峰脱去糖基碎片形成的脱60、90、120的离子。黄酮氧苷一般显示脱去162和146等糖基形成的碎片离子。黄酮类化合物主要为不同数量和位置的羟基和氧甲基取代，主要显示[M–H]^–和连续的脱CH₃·的信号，一般有几个氧甲基就脱几个CH₃，而且羟基被甲基取代后，其保留时间明显增长。

M5和M6的精确分子离子提示其分子式为C₁₈H₃₀O₃，再根据保留时间和文献报道^[29]，推测其可能为亚油酸和11(E)-十八碳二烯酸。

将21批次样品的紫外和质谱色谱图分别叠加比对，可以确定不同批次样品中紫外和质谱上的共有峰，见图2。共有峰有1～5、9、11～14、16、18～23、25、26，其中峰12、14、16、18、19 5个化合物没有找到对照品确定他们的结构。所以拟建立这14个共有化合物的含量测定方法来进行艾叶质控的研究。

 

2.5  定量测定

2.5.1  线性关系考察  取稀释好的混合对照品溶液，每个浓度进样1 μL，按上述“2.1”项下的条件进样分析，以峰面积为纵坐标，以各对照品的质量浓度为横坐标建立标准曲线。计算的14个对照品的线性回归方程、相关系数、线性范围、最低定量限和最低检测限见表3。结果表明艾叶中14种化学成分有良好的线性范围和线性关系，且检测灵敏度较高。

2.5.2  精密度试验  取混合对照品溶液，按“2.1”项下条件连续进样6次，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、夏佛塔苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、芹菜素、高车前素、棕矢车菊素、5,7,3′-三羟基-6,4′,5′-三甲氧基黄酮、异泽兰黄素、蔓荆子黄素色谱峰峰面积的RSD分别为1.25%、1.07%、1.18%、1.15%、1.35%、0.99%、1.24%、1.28%、1.22%、1.2%、1.17%、1.19%、1.08%、1.13%，结果表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验  精密称取艾叶0.2 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件分别于0、2、4、8、16、24、48、72 h进样1 μL分析，计算样品中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、夏佛塔苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、芹菜素、高车前素、棕矢车菊素、5,7,3′-三羟基- 6,4′,5′-三甲氧基黄酮、异泽兰黄素、蔓荆子黄素含量的RSD值分别为1.2%、1.11%、1.25%、1.24%、1.09%、1.16%、1.01%、1.13%、1.25%、1.11%、1.08%、1.14%、1.12%、1.22%。

2.5.4 重复性试验  精密平行称取6份同一批艾叶0.2 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件进样分析，计算样品中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、夏佛塔苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、芹菜素、高车前素、棕矢车菊素、5,7,3′-三羟基-6,4′,5′-三甲氧基黄酮、异泽兰黄素、蔓荆子黄素含量的RSD值分别为2.10%、2.22%、1.92%、1.54%、1.85%、1.28%、1.64%、1.77%、1.45%、1.23%、1.12%、1.41%、1.21%、1.23%。

2.5.5  加样回收率试验  精密称定已知含量的同一批艾叶9份，各0.2g，按照1∶0.8、1∶1、1∶1.2的质量比例分别精密加入单一对照品溶液，每个比例3份，N₂气流挥干溶剂后，按“2.3”项下条件制备供试品，按“2.1”项下色谱条件进行分析，计算各对照品的加样回收率，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、夏佛塔苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、芹菜素、高车前素、棕矢车菊素、5,7,3′-三羟基-6,4′,5′-三甲氧基黄酮、异泽兰黄素、蔓荆子黄素含量的加样回收率分别为94.9%、96.7%、96.9%、96.5%、103.6%、100.8%、100.5%、99.2%、98.6%、102.0%、100.8%、97.4%、99.3%、97.2%。

2.5.6  样品含量测定  取21不同批次的艾叶，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，每个样品重复3次，含量取3次平均值。按“2.1”项方法测定了14个化合物的含量，结果见图3和表4。

3  讨论

通过UPLC-UV-Q/TOF MS分析，确定了艾叶70%醇提物中在紫外和质谱上均具有良好响应的化合物，推测了21批次样品中32个化合物的结构，其中共有的色谱峰19个，并通过对照品比对确定了其中了15个化合物的结构（异夏佛塔苷含量太低，没有进行含量测定）。为了更好的分离表征艾叶中的代谢物尤其是其中14个化合物的分离，选择了HSST3、HSS C₁₈、BEH C₁₈等色谱柱，甲醇-水、乙醇-水以及甲酸和磷酸等流动相和添加剂进行色谱条件的进一步优化，14个化合物得到了良好分离，建立了其UPLC-UV的含量测定方法。同时我们还进行了TOF和UV的定量结果比对，发现质谱的定量灵敏度虽然能高1个数量级，但定量范围稍窄，不适合同时定量分析含量差异较大的化合物，如异绿原酸A（含量较高，上限超出线性范围）和高车前素等。艾叶中主要含有绿原酸类和黄酮类化合物，其中绿原酸类含量较高，异绿原酸A的含量最高，黄酮类化合物中夏佛塔苷、棕矢车菊素和异泽兰黄素的含量较高。咖啡酸、绿原酸、异泽兰黄素等化学物质，也正是止血、抗氧化、抗炎、抗肿瘤的主要药效基础^[14-18]。不同产地艾叶中的各化合物的含量差异较大，个别化合物的含量差异在10倍以上；同样蕲春的艾叶，不同储藏时间、不同采集时间的含量也具有一定差异。本研究结果和文献报道^[24-25]的含量较为一致，但具体数值上有一定差异。这说明了艾叶质量除了和产地相关外，和艾叶的海拨高度、采收时间、晾晒方式、储藏（绿原酸类化合物在不同环境下的稳定性可能有差异）等相关，需要更多的研究阐明影响艾叶质量不同因素的作用。制定艾叶的质量标准还需要更深一步的研究。

该方法虽然可以较为全面的评价艾叶的质量，但存在使用对照品较多的情况，有学者研究了一测多评方法进行6个绿原酸类化合物的含量测定^[30]，可以较好的减少对照品的使用^[31]。另外使用标准提取物进行不同样品的质量控制研究可以更大程度的减少对照品的使用，并全面控制药材质量。艾叶的系统植化研究还不够深入，本实验中含量较高的几个未定量化合物和未鉴定结构的化合物都还需要进一步的分离鉴定研究。

 

参考文献（略） 

来  源：兰晓燕，朱龙波，黄显章，刘大会，郝庆秀，周  利，杨  健，郭兰萍，张  元，康利平．艾叶中主要化学成分的鉴定及其含量测定研究  [J]. 中草药, 2021, 52(24): 7630-7637.